在新開發(fā)或改進(jìn)生物催化劑時,通常要進(jìn)行微生物采集,測定酶突變體表達(dá)文庫或者宏基因組文庫的酶活性,高通量活性篩選是關(guān)鍵步驟之一。理想情況下,篩選是在操作條件下的可靠反應(yīng),反應(yīng)進(jìn)程用分析儀器如高效液相色譜儀、氣相色...[繼續(xù)閱讀]

    醇脫氫酶將NAD(P)+轉(zhuǎn)化為NAD(P),在340nm處使用紫外或熒光能檢測到這一反應(yīng)。然而,信號往往會被污染物或其他檢測組分所掩蓋,如檢測是在全細(xì)胞中或存在其他發(fā)色團(tuán)時,還原型輔因子非常不穩(wěn)定。信號穩(wěn)定在間接檢測中也是一個問題...[繼續(xù)閱讀]

    20世紀(jì)90年代,醛縮酶催化抗體的發(fā)現(xiàn)使得人們在篩選非天然醛縮酶型底物生物轉(zhuǎn)化醛醇縮合反應(yīng)方面的興趣日增[6～8]。上面提到的醇脫氫酶(ADH)檢測可以在丁間醛醇底物形式上修飾,例如底物6通過逆丁間醛醇/順序β-消除反應(yīng)來檢測逆...[繼續(xù)閱讀]

    圖式1-3轉(zhuǎn)醛醇酶和轉(zhuǎn)酮醇酶的熒光底物coum:圖中化合物10的縮寫轉(zhuǎn)醛醇酶10～12(圖式1-3)的相關(guān)體系后來被開發(fā)[12]。各種轉(zhuǎn)醛醇酶的戊酮型/己酮型立體異構(gòu)性可以通過熒光立體異構(gòu)底物對11/12檢測。然而與天然底物相比,這些底物的轉(zhuǎn)...[繼續(xù)閱讀]

    醛縮酶類生物催化劑通常希望用來催化酮供體的烯醇化。然而通過熒光直接檢測烯醇化作用是不可能的。最近發(fā)現(xiàn),二羥基丙酮香豆醚14可以作為在水緩沖溶液中的一種熒光烯醇化探針(圖式1-4)[16]。通過傘形酮的β-消除反應(yīng)形成烯醇...[繼續(xù)閱讀]

    傘形酮酯或硝基苯酚酯作為脂肪酶底物的缺點(diǎn)在于它們的低水溶性和高的非特異性。因?yàn)橹久甘墙缑婷?因此一直在進(jìn)行檢測設(shè)計的探索:這些底物在酶溶液中是穩(wěn)定的,且在高表面積的材料上不溶。實(shí)現(xiàn)這個設(shè)計最好是使用浸漬硅...[繼續(xù)閱讀]

    夾子-O底物是水解酶熒光和顯色底物的最可靠種類之一,特別是脂肪酶(例如19)[30～32]。這些底物依據(jù)于雙間接釋放機(jī)制,1,2-伯二醇產(chǎn)物與高碘酸鈉形成的不穩(wěn)定的醛或酮連續(xù)開環(huán),產(chǎn)生熒光信號(例如21),經(jīng)過β-消除反應(yīng)釋放傘形酮5或硝...[繼續(xù)閱讀]

    在脂肪酶和酯酶底物的酯功能上,通常使用脂肪族醇而不是酸性苯酚類化合物,這是獲取這些酶選擇性探針的關(guān)鍵。在這種情況下,利用伯醇產(chǎn)物的氧化分解即可得到解決。熒光氰醇和羥基酮能自發(fā)反應(yīng)生成熒光苯酚,接著是連續(xù)β-消除...[繼續(xù)閱讀]

    傘形酮能與多種脂肪酸氯甲基酯烷基化反應(yīng),產(chǎn)生乙酰氧甲基醚,且得率不錯(例27)[38]。這些底物在緩沖液中經(jīng)過脂肪酶/酯酶-催化水解反應(yīng)形成傘形酮(圖式1-9)[39]。其機(jī)制可能涉及一個不穩(wěn)定的半縮醛中間體,它能自發(fā)反應(yīng)生成甲醛和...[繼續(xù)閱讀]

    FRET(熒光或Förster共振能量轉(zhuǎn)移)是最基本的原則之一,用來設(shè)計裂解反應(yīng)的熒光底物和眾所周知的蛋白酶和脂肪酶底物。盡管雙重標(biāo)記強(qiáng)烈影響反應(yīng)活性,但應(yīng)用脂肪酶FRET底物仍然得到了研究。圍繞1,2-二醇單酯功能的各種變量調(diào)查...[繼續(xù)閱讀]